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本试剂盒用于检测细胞凋亡早期的发生，其中Annexin V为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙离子依赖的方式选择性与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。

PS正常分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把PS外翻到细胞膜外侧。用带有FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到PS的外翻这一细胞凋亡的重要特征。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，在嵌入DNA后释放红色荧光。PI不能穿透完整的细胞膜，但可以穿透坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

FITC最大吸收波长为490nm，激发波长为525nm；
PI-DNA复合物的最大吸收和发射波长分别为535nm和615nm。



图1.在凋亡激活剂2(MB4124)孵育C6细胞(大鼠神经胶质瘤细胞)1.5小时后，使用我公司Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测染色效果图。仅被绿色荧光染色的为凋亡前期细胞，被绿色和红色双染的是凋亡晚期或坏死细胞。


图2.使用我公司Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒染色后流式细胞仪检测效果图。A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)用100μM凋亡激活剂2(MB4124)作用5小时后，未经染色(A)、仅用本试剂盒中的PI进行染色(B)、仅用本试剂盒中的Annexin V-FITC进行染色(C)、用本试剂盒中的Annexin V-FITC和PI进行双染(D)。从图中可以看出，未经染色的是双阴性细胞(A)，仅PI染色后出现了预期的PI染色阳性的细胞，仅Annexin V-FITC染色出现了预期的Annexin V-FITC染色阳性的细胞，Annexin V-FITC和PI双染出现了预期的仅Annexin V-FITC染色阳性的早期凋亡细胞和双阳性的晚期凋亡细胞。出现的非预期的细胞点完全在许可的误差范围内。实测数据可能会因细胞类型、细胞凋亡情况、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

组分	10T	50T	100T
Annexin V-FITC	50μL	250μL	500μL
Propidium iodide	100μL	500μL	1mL
Binding Buffer(10×)	5mL	25mL	50mL
说明书	1份

保存：2～8℃避光，不可冷冻，有效期1年。

• 可立式离心管内试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)是光敏物质，在保存与操作时请注意避光。
  
• 在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留影响实验结果。
  
• 为获得准确试验结果，建议样品在Annexin V-FITC染色后1小时内进行分析。
  
• 为了您的安全和健康，请穿戴实验防护服、手套、口罩等必要的防护装备。

• 样品染色
  
  • 将Binding Buffer(10×)稀释成1×Binding buffer工作液备用(1mL Binding Buffer(10×)需加入9mL无菌去离子水)。
    
  • 对于悬浮细胞：500～1000g离心5min收集细胞。
    对于贴壁细胞：要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短，最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，加入细胞培养液，将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，500～1000g离心5min收集细胞。
    
  • 收集细胞后，加入预冷PBS溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次。
    
  • 在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重悬细胞，使细胞浓度达到1×10⁶ cell/ml。
    
  • 吸取100μL细胞悬液(细胞总数为1×10⁵ cell)至一新管中，加入5μL Annexin V-FITC和5～10μL PI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。
• 样品检测
  
  • 流式细胞仪检测：
    染色孵育后，每管加入400μL 1×Binding Buffer工作液，混匀后使用流式细胞仪检测(1小时内检测)。
    建议设置经凋亡诱导的正常细胞、PI单染和Annexin V-FITC单染3个对照组，正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。结果可用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dot plot)，FITC为横坐标，PI为纵坐标。Annexin V-FITC和PI联合使用时，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色双重荧光。
    
  • 荧光显微镜检测：
    染色孵育后涂片，显微镜下观察。使用荧光显微镜上的蓝光和绿光通道分别观察FITC和PI。被Annexin V-FITC结合的细胞显示浆膜上有绿色光环。丧失细胞膜完整性的细胞，细胞核显示红色，膜上有绿色光环。

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